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蛋白質(zhì)紫外吸收與濃度測定

2022-06-20
563次

在蛋白和抗體純化工作中,如何準確的進(jìn)行定量一直是一個(gè)棘手的問(wèn)題。傳統的方如Bradford,BCA等操作繁瑣,耗時(shí)長(cháng),而通過(guò)測定蛋白質(zhì)的紫外吸收來(lái)定量,則非??焖俜奖?。

蛋白質(zhì)擁有的紫外吸收性質(zhì)是來(lái)自芳香族氨基酸如色氨酸、酪氨酸分子內含有共軛雙鍵,在280納米波長(cháng)附近具有最大的光吸收峰。由于大多數蛋白質(zhì)均含有酪氨酸、色氨酸殘基,所以測定蛋白質(zhì)在280納米波長(cháng)處的吸光度,是分析溶液中蛋白質(zhì)含量的一種最快速簡(jiǎn)便的方法。

其優(yōu)點(diǎn)是快速,對樣品無(wú)破壞,缺點(diǎn)在于此法是根據酪氨酸(Tyr),苯丙氨酸(Phe),色氨酸(Trp)殘基的強吸收值來(lái)測定的,不同的蛋白質(zhì)其含量不同,所以當蛋白中缺乏這幾種氨基酸時(shí),定量就不準了,就得考慮其他方法。另外核酸,和其他所有含有苯環(huán)共軛π鍵的物質(zhì)(如蛋白洗脫用的咪唑)都會(huì )影響其定量,在測定前應先透析除去。

 

一、如何利用微量分光光度計來(lái)測定蛋白濃度

01  首先打開(kāi)軟件,選擇Protein A280。

02  再在右上角選擇樣品的類(lèi)型,1Abs=1mg/ml為測定未知蛋白的選項(如果是測試抗體濃度,可以選擇igG預設參數,大部分廠(chǎng)家的設備都含有這個(gè)參數)。

03  然后用純水將比色皿清洗三次,選擇合適的溶液作為背景,滴入2μl,按blank減去背景。再用純水將比色皿清洗三次,滴入2μl樣品,按measure測定。下方就會(huì )顯示樣品的A280值即為濃度。

04  到這一步還沒(méi)完!

還需要到https://web.expasy.org/protparam/,上輸入蛋白的序列來(lái)查找消光系數,用測得的A280除以該蛋白的消光系數,才是最終的準確濃度。

菲恩生物嚴格把控每一個(gè)生產(chǎn)的蛋白或抗體產(chǎn)品的質(zhì)量,質(zhì)控方面使用傳統的SDS-Page膠染色,對比標準品濃度的BSA蛋白,確定濃度和純度,同時(shí)參考全進(jìn)口微量分光光度計以獲得最準確的數據,讓產(chǎn)品在純度和濃度上不會(huì )出現偏差。

二、舉例菲恩生產(chǎn)蛋白驗證的過(guò)程的結果圖(DOG43為蛋白編號)

01  12%SDS-PAGE驗證(其中BSA標準品為1mg,上樣10ul)

02  DOG43蛋白序列進(jìn)行分析,計算消光系數。

03  微量分光光度計濃度測定結果。

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