監(jiān)控OD620數(shù)據(jù)精確控制TMB顯色法
原理:
TMB顯色劑主要成分是二,二甲基聯(lián)苯胺(非致癌HRP底物),氧化失去電子后變成電子轉(zhuǎn)移復(fù)合物(TMB+和TMB),復(fù)合物最大吸收峰652nm(藍色),當(dāng)加入酸性物質(zhì)后導(dǎo)致電子轉(zhuǎn)移復(fù)合物質(zhì)子化,迫使兩者分離出一分子的TMB(無色),一分子TMB+(黃色琨,最大吸收峰450nm),同時酸性條件下HRP酶失活,顯色停止。
因此652的數(shù)據(jù)正向?qū)?yīng)450的數(shù)據(jù),(實驗室使用620nm相對652誤差10%)。
監(jiān)控的OD620(藍色)和終止后對照450表格
部分項目顯色控制情況:
顯色控制,精確計算注意事項:
1、酶標(biāo)儀讀取TMB+
450nm的最佳設(shè)備分辨率是3.0以下,在2.2以下有非常好的線性(2倍關(guān)系)。如果是定量,顯色不易過深,參考數(shù)據(jù)為Thermo FC酶標(biāo)儀提供。注意:不同廠家的酶標(biāo)儀靈敏度存在差異。
2、使用專業(yè)的曲線軟件,推薦軟件可以在菲恩網(wǎng)站下載(技術(shù)支持-下載),如果是拋物線建議使用四參數(shù)方程(MMF)計算。
3、顯色過深后(OD450>3.5),TMB+濃度較高,其溶解性大大低于TMB,會緩慢形成結(jié)晶并沉淀在孔底部(黑色針狀顆粒),黃色會消退,應(yīng)立即讀數(shù)。過深的顯色會在12小時后在孔底部出現(xiàn)大量黑色結(jié)晶,而無法保留黃色。