ELISA樣本制備指南

ELISA是一種快速、靈敏、準(zhǔn)確可靠的定性定量分析方法。樣本的處理對(duì)于Elisa實(shí)驗(yàn)的成功起著關(guān)鍵的作用。處理樣本的過程就是收集目標(biāo)蛋白的過程，由于蛋白容易變性，降解，故該過程應(yīng)盡量溫和。樣本處理之后的儲(chǔ)存也非常重要，尤其注意不要反復(fù)凍融。樣本處理之后可分裝密封保存，最佳保存條件：2-8℃保存應(yīng)小于5天，-20℃不應(yīng)超過6個(gè)月，-80℃不應(yīng)超過2年，超過以上時(shí)間應(yīng)保存在液氮中。凍存的標(biāo)本融化時(shí)，為了減少冰晶(0度)對(duì)樣品的破壞，應(yīng)采用15-25℃水浴快速融化，融化后可用于檢測(cè)或暫存于2-8℃。

利用ELISA進(jìn)行檢測(cè)的樣本類型包括：血液(血清、血漿)、組織勻漿、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)上清、尿液、糞便、肺泡灌洗液、唾液、腦脊液、胸腹水、前列腺液、精液、陰道分泌物等。常見的樣本處理方法如下，僅供參考：

A、血液樣本

1、血清：

1.1、將收集于血清分離管的全血樣本，在室溫放置2小時(shí)或2-8℃過夜。(這是一個(gè)讓血液自然凝固的過程，溫度越低，凝集越緩慢，可根據(jù)需要添加促凝劑)

1.2、1000×g離心20分鐘，取上清。

1.3、可立即檢測(cè)，或分裝凍存于-20℃或-80℃。

2、血漿(檸檬酸，EDTA,肝素)：

2.1、血漿樣本需要抗凝，將全血收集到干凈的含抗凝劑的試管中，輕輕混勻。

2.2、標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清。

2.3、可立即檢測(cè)，或分裝凍存于-20℃或-80℃。

抗凝劑的類型和選擇：

根據(jù)待檢測(cè)目標(biāo)物的性質(zhì)不同選取不同的抗凝劑。

枸櫞酸鈉(檸檬酸鈉)：Ca2+有凝血作用，枸櫞酸鈉能與血液中的Ca2+形成可溶性的螯合物，從而阻止血液凝固。檸檬酸鈉抗凝工作濃度一般為0.25%。(使用4.0%濃度規(guī)格的抗凝劑時(shí)，抗凝劑與血液的比例為1:16)

缺點(diǎn)：血液中溶解度低，抗凝作用較弱。

優(yōu)點(diǎn)：對(duì)凝血因子有很好的保護(hù)作用，大部分凝血試驗(yàn)都可用枸櫞酸鈉抗凝。

乙二胺四乙酸(EDTA)鹽：與血液中的Ca2+結(jié)合形成配位化合物，從而阻止血液凝固。EDTA的抗凝工作濃度為：10ml血液含12mgEDTA。

優(yōu)點(diǎn)：對(duì)紅細(xì)胞和白細(xì)胞形態(tài)影響小。

缺點(diǎn)：影響血小板的聚集。不適用于凝血實(shí)驗(yàn)和血小板功能相關(guān)實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)。

肝素：通過與抗凝血酶Ⅲ結(jié)合，增強(qiáng)抗凝血酶的作用，滅活絲氨酸蛋白酶，從而阻止凝血酶的形成和阻止血小板聚集，阻止血液凝固。純的肝素10mg能抗凝65~125ml血液。

優(yōu)點(diǎn)：抗凝能力強(qiáng)，不影響血細(xì)胞體積，不易溶血，能耐高溫。

缺點(diǎn)：引起白細(xì)胞聚集。肝素抗凝血應(yīng)于短時(shí)間內(nèi)使用，否則放置過久血液又可凝固。

血清/血漿的區(qū)別與選擇：

血清是血液凝固后缺少纖維蛋白原的血漿，故血漿中除含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均等同于血清。由于血清中缺乏很多的凝血因子，但有凝血產(chǎn)物。如果檢測(cè)凝血因子，建議選擇血漿樣本；因血漿中有纖維蛋白原，如果纖維蛋白原對(duì)待檢測(cè)指標(biāo)有影響，建議選擇血清樣本；大多數(shù)情況下二者均可以選擇。

B、組織樣本：

組織樣本一般制成組織勻漿，處理方法如下：

1、使用干凈的工具解剖目標(biāo)組織，盡快置于冰上，以防被蛋白酶降解。(暫時(shí)不處理的組織，置于圓底微量離心管中，浸入液氮中“速凍”，在-80℃下存儲(chǔ)樣品備用)

2、用預(yù)冷的PBS緩沖液(0.01M，pH=7.4)洗滌組織去除殘留的血液，稱重后備用。若組織塊較大，需先剪碎。

3、在冰上用研磨緩沖液(常用PBS緩沖液，但最好使用50mMTris+0.9%NaCL+0.1%SDS,PH7.3。或者中等強(qiáng)度RIPA細(xì)胞裂解液，注意RIPA裂解液PH值需為PH7.3，建議不要使用含NP-40，TritonX-100和高濃度DTT的組分，會(huì)抑制抗原抗體反應(yīng)。)研磨組織勻漿(加入研磨緩沖液的體積取決于組織的重量。一般情況下，每1克組織碎片應(yīng)使用9ml研磨緩沖液。另外建議在研磨緩沖液中加入一些蛋白酶抑制劑，如1mM PMSF)。得到的勻漿液可再利用超聲破碎或反復(fù)凍融進(jìn)一步處理(超聲破碎過程中，需冰浴降溫；反復(fù)凍融法可重復(fù)2次)。

4、將制備好的勻漿液于5000×g離心5分鐘，留取上清即可檢測(cè)。或分裝凍存于-20℃或-80℃。

5、根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，組織勻漿樣本可先定量總蛋白,以便于統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，一般調(diào)整總蛋白濃度至1-3mg/ml。某些組織樣本，如肝臟，腎臟，胰腺因含有較高濃度的內(nèi)源性過氧物酶,在樣品濃度較高的情況下會(huì)和試劑盒底物反應(yīng)出現(xiàn)假陽性。

注意事項(xiàng)：

若為皮膚組織，離心后，需去除上層脂肪，以及下層沉淀，取中間層樣本用于檢測(cè)。

C、細(xì)胞樣本：

1、細(xì)胞培養(yǎng)上清：

1.1、使用96，24，6孔板，(貼壁或懸浮)細(xì)胞密度達(dá)到60-90%。

1.2、使用6-10mm培養(yǎng)皿，T25/T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶，(貼壁或懸浮)細(xì)胞密度達(dá)到60-90%。

1.3、懸浮細(xì)胞：2-8℃，2500rpm離心5min，收集澄清的細(xì)胞培養(yǎng)上清。

1.4、貼壁細(xì)胞：直接收集上清液，2-8℃，2500rpm離心5min，收集澄清的細(xì)胞培養(yǎng)上清。

1.5、立即用于檢測(cè)，或分裝于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/span>

2、細(xì)胞裂解液：

2.1、懸浮細(xì)胞：

2.1.1、2-8℃，2500rpm離心5min，收集細(xì)胞。

2.1.2、加入預(yù)冷的PBS,輕輕混勻，2-8℃，2500rpm離心5min，收集細(xì)胞。

2.1.3、加入0.5-1ml中等強(qiáng)度RIPA細(xì)胞裂解液(注意RIPA裂解液PH值需為PH7.3，建議不要使用含NP-40，TritonX-100和高濃度DTT的組分，會(huì)抑制抗原抗體反應(yīng)。若無RIPA裂解液，可使用50mMTris+0.9%NaCL+0.1%SDS,PH7.3)及適量蛋白酶抑制劑(如PMSF，工作濃度1mmol/L),置于冰上，裂解30min-1h。裂解過程中可用槍頭吹打或間斷搖動(dòng)離心管，使蛋白充分裂解,出現(xiàn)黏糊狀是DNA，可以使用超聲波破碎DNA。(或用超聲波3-5mm探頭，功率150-300W,冰上超聲處理樣品，工作1-2s，停止30秒，3~5個(gè)循環(huán))

2.1.4、裂解或超聲破碎完成，2-8℃，10000rpm離心10min，上清移入EP管中，立即用于檢測(cè)，或分裝于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/span>

2.2、貼壁細(xì)胞：

2.2.1、吸走上清液，加入預(yù)冷的PBS洗三次。

2.2.2、加入0.5-1mlRIPA細(xì)胞裂解液及適量蛋白酶抑制劑(具體要求同懸浮細(xì)胞)，用細(xì)胞刮輕輕刮下貼壁細(xì)胞。

2.2.3、細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中，置于冰上，裂解30min-1h，或者配合超聲波破碎(同懸浮細(xì)胞)。

2.2.4、裂解或超聲破碎完成，2-8℃，10000rpm離心10min，上清移入EP管中，立即用于檢測(cè)，或分裝于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/span>

注意事項(xiàng)：

細(xì)胞裂解液，建議使用超聲波輔助破碎，超聲波可有效打斷DNA，DNA成為片段后不容易干擾試劑盒工作。

細(xì)胞培養(yǎng)上清液/細(xì)胞裂解液的選擇：

根據(jù)目的物所在部位，可選擇細(xì)胞裂解液或細(xì)胞培養(yǎng)上清作為樣本。

如果目的物是分泌型，(包括可分泌型的膜蛋白)，即可選擇細(xì)胞培養(yǎng)上清作為樣本；

如果目的物主要存在于胞內(nèi)，則建議選擇細(xì)胞裂解液作為樣本類型，部分包內(nèi)蛋白也可能通過分泌或者細(xì)胞凋亡而泄露到培養(yǎng)基中而上清也可被檢測(cè)。

D、痰液

1、選擇痰液中較為粘稠部分稱重，加兩倍于痰量的0.1%DTT(二硫蘇糖醇,主要作用是溶解粘液)，反復(fù)吹打，漩渦器振蕩15s，37度恒溫水浴振蕩5分鐘；

2、加兩倍于痰量的PBS緩沖液,繼續(xù)振蕩15-20分鐘，150目的金屬絲網(wǎng)過濾，1500rpm離心10分鐘吸取上清液檢測(cè)。

E、唾液/尿液/牛奶

用無菌管收集樣品，2-8℃下以10,000xg離心2分鐘?；?span style="box-sizing: border-box;border-width: 0px;border-style: solid;border-color: #E5E7EB;--tw-border-spacing-x: 0;--tw-border-spacing-y: 0;--tw-translate-x: 0;--tw-translate-y: 0;--tw-rotate: 0;--tw-skew-x: 0;--tw-skew-y: 0;--tw-scale-x: 1;--tw-scale-y: 1;--tw-pan-x: ;--tw-pan-y: ;--tw-pinch-zoom: ;--tw-scroll-snap-strictness: proximity;--tw-ordinal: ;--tw-slashed-zero: ;--tw-numeric-figure: ;--tw-numeric-spacing: ;--tw-numeric-fraction: ;--tw-ring-inset: ;--tw-ring-offset-width: 0px;--tw-ring-offset-color: #fff;--tw-ring-color: rgb(59 130 246 / 0.5);--tw-ring-offset-shadow: 0 0 #0000;--tw-ring-shadow: 0 0 #0000;--tw-shadow: 0 0 #0000;--tw-shadow-colored: 0 0 #0000;--tw-blur: ;--tw-brightness: ;--tw-contrast: ;--tw-grayscale: ;--tw-hue-rotate: ;--tw-invert: ;--tw-saturate: ;--tw-sepia: ;--tw-drop-shadow: ;--tw-backdrop-blur: ;--tw-backdrop-brightness: ;--tw-backdrop-contrast: ;--tw-backdrop-grayscale: ;--tw-backdrop-hue-rotate: ;--tw-backdrop-invert: ;--tw-backdrop-opacity: ;--tw-backdrop-saturate: ;--tw-backdrop-sepia: ">2000-3000rpm離心20分鐘，收集上清液，可立即檢測(cè)，或分裝凍存于-20℃或-80℃。盡量減少凍融循環(huán)。

F、糞便

1、盡量采集干的糞便，糞便過稀會(huì)較難處理且降低檢測(cè)的準(zhǔn)確性。采集的重量應(yīng)大于50mg。

2、將糞便用PBS洗3次，離心收集沉淀后稱重。

3、加入PBS緩沖液(加入PBS緩沖液的體積取決于處理后糞便的重量。一般情況下，每1克糞便應(yīng)使用9mlPBS緩沖液)，用超聲粉碎(或搗碎)。

4、5000×g離心10分鐘，取上清檢測(cè)?；蚍盅b凍存于-20℃或-80℃備用。

G、精漿

1、將精液收集于無菌容器中，正常精液射出體外呈稠厚的膠凍狀，射出體外后需在室溫或37度水浴箱中使其在前列腺分泌的纖維蛋白溶解酶的作用下液化變得稀薄。

2、待精液完全液化后，將精液于4000rpm離心10分鐘分離精漿，進(jìn)行檢測(cè)，或分裝凍存于-20℃或-80℃備用。

H、腦脊液、肺泡灌洗液，滑膜液，腹水

采集樣品,于1000×g離心20分鐘，收集上清，可立即檢測(cè)，或分裝凍存于-20℃或-80℃。盡量減少凍融循環(huán)。

I、乳汁

采集樣品,在2-8℃下12000rpm離心30分鐘，去除上層脂肪，以及下層沉淀，取中間層樣本用于檢測(cè)?；蚍盅b凍存于-20℃或-80℃。盡量減少凍融循環(huán)。

J、蛋黃(檢測(cè)鳥類igY(也稱igG))

1、取新鮮蛋黃，用超純水稀釋10倍。

2、用鹽酸調(diào)pH至5.0~5.2，2-8℃靜置6h,然后10000rpm離心10min，收集上清,調(diào)整PH至7.2-7.4，立即用于檢測(cè)或分裝凍存于-20℃或-80℃。